Enterales Nervensystem
Mit der hier vorgestellten Methode von Schäfer, Saffrey, Burnstock und Mestres-Ventura wird eine erleichterte Präparation des Plexus Myentericus aus dem Magen-Darm-Trakt vorgestellt. Das Verfahren besteht aus einer manuellen Präparation und einer nachfolgenden enzymatischen Behandlung, zur Gewinnung der vorhandenen Ganglienzellen. Der Vorteil dieser Methode ist die Isolation einer Vielzahl von Ganglienzellen in kurzer Zeit (3-4 Stunden), die nachfolgend sofort zur Untersuchung geeignet sind.
Materialien: Für die hier vorgestellte Studie wurden neugeborene Ratten verschiedenen Geschlechts in einem Alter von 0 - 21 Tagen verwendet. Die Fütterung und Tränke erfolgte ad libitum.
Spezielle Materialien: Uhrmacherpinzette (Dumont Größe 4 + 5), Geudeur Iridektomie Schere (105 mm), Feine Schere (100 - 120 mm), Schüttler (Vortex-Genie, SI), Schott Beleuchtungseinheit (Kaltlicht mit Schwanenhals, KLL 1500, 2 Lichtquellen), Kryotubes (Greiner, 1.8 ml).
Chemikalien: Hepes-gepuffertes minimal essential medium (MEM - 25 - mM Hepes), Kollagenase Typ II (Worthington, 1 mg/ml), DNAse (Boehringer, 1 mg/ml), Trypsin (Gibco, 0.05%).
Genaue Beschreibung: Der Magen-Darm-Trakt wird von kaudal nach kranial freipräpariert. Hierbei sollten möglichst nur die gewünschten Anteile isoliert werden, ohne Mesenterial- und Fettbestandteile. Nach der Isolation des Magen-Darm-Traktes wird die Muskelschicht mit den Plexen von der Mucoa getrennt. Dies geschieht mit Hilfe eines Stereomikroskopes (170fach) und Verwendung von Uhrmacherpinzetten (Größen 4 + 5). Die Muskelschicht wird in einer Art Schlauch "abgezogen".
Das nun zur Verfügung stehende Material wird in Kryotubes gefüllt, die mit Kollagenase (1 mg/ml, je nach Kollagenase kann die Konzentration stark variieren ) gefüllt sind, und für 0.5 - 2.5 Stunden inkubiert (37°C, 5 % CO2 (Vol/Vol)). Nach dieser Zeit wird das behandelte Gewebe mit einem Schüttler für 15 - 30 Sekunden behandelt. Das teilweise verdaute Gewebe wird nun unter dem Stereomikroskop (340fach) nach vorhanden Pelxus-Netzen durchsucht. Je nach Alter und Lokalisation des inkubierten Gewebes sind mehr oder weniger freie Ganglien-Netze zu sehen. Diese können dann mit einer 250µl Pipette gesammelt werden. Wenn nicht genügend Ganglien-Anteile freigesetzt worden sind, muß die ganze Prozedur wiederholt werden, also Aufsammeln der nicht richtig verdauten Gewebestücke und Reinkubation dieser in 1 mg/ml Kollagenase. Die Reinkubation sollte jedoch jetzt nicht länger als eine halbe Stunde dauern.
Dieses Verfahren kann bis zu 3 - 4 mal wiederholt werden. Wenn viele Ganglien-Netze sichtbar sind, aber noch nicht vollkommen vom Muskelgewebe getrennt sind, ist es sinnvoll diese Gewebeteile einzusammeln und in einer Trypsinlösung (1 mg/ml) für etwa 10 Minuten zu inkubieren (anstelle einer Kollagenase-Inkubation). Nach Inkubation und Schüttlung sollte das trypsinbehandelte Gewebe mit DNAse behandelt werden, um Verklebungen zu vermeiden. Das so isolierte Material (Abb. 1) kann in einer gekühlten Nährlösung gesammelt werden und ist je nach Verwendungszweck direkt verfügbar.
Abb. 1 Isolierter Anteil Plexus myentericus (Foto: Martin Diener).