A5 - Charakterisierung der Aktivität von Peptiden und Oligosacchariden in Milch im Hinblick auf eine gesunde Ernährung

Projektleiter
Prof. Dr. G. Erhardt, Prof. Dr. C. Kunz

Mitarbeiter
Dr. S. Kuntz, PD Dr. S. Rudloff, Dr. C. Weimann,


Charakterisierung der Aktivität von Peptiden
Die in der Milch vorkommenden Proteine (αS1-Kasein (CSN1S1), αS2-Kasein (CSN1S2), β-Kasein (CSN2) und κ-Kasein (CSN3), α-Lactalbumin (LAA) und β-Lactoglobulin (LGB)) weisen verschiedene genetische Varianten auf, die sich auf die jeweiligen Aminosäuresequenzen und damit auch auf die bei der Spaltung entstehenden Peptide auswirken. Je nach Variante des Milchproteins können somit andere oder eventuell neue bioaktive Peptide entstehen, deren anti¬hypertensive Wirkung überprüft werden soll. Milchproben von in Deutschland vor¬kommenden Rassen sollen zunächst mittels isoelektrischer Fokussierung in den polymorphen Protein¬systemen charakterisiert werden. Nachfolgend werden die verschiedenen Milchproteinvarianten auch unter Einbeziehung der bereits vorhandenen Datenbank mit zum Teil sehr seltenen Varianten in vom Aussterben bedrohten Rinderrassen (s. Abbildung 1) in silico zur Identifizierung von biologisch aktiven Peptiden analysiert. Um die biologische Wirksamkeit der identifizierten Peptide zu über¬prüfen, werden diese anschließend in verschiedenen in vitro Systemen getestet.

Vorträge
Erhardt, G. (2004): Genetische Varianten in der Milch – Bedeutung für Tierzucht und Humanernährung. Hochschultagung des Fachbereichs 09 der JLU Gießen am 10.12.2004.
Caroli, A., Erhardt, G. (2005): Milk protein variants for animal breeding and human nutrition.
13. Congresso Internazionale Della Fe.Me.S.P.Rum, 01.09.-03.09.2005, Valenzano, Bari, Italien.
Erhardt, G. (2005): Die Bedeutung der Milchproteine für die Tierzucht und die menschliche Ernährung. Kolloquium "Molekulargenetische und physiologische Merkmale in der Rinderzucht", 23.03.2005, Dummerstorf.


MEU-Vernetzung und externe Kooperationen
Nutzung der „MEU-Methodenplattform Stabile Isotope und Zellbiologie”;
Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Professor Jerzy Dziuba vom Department of Food Chemistry /Olsztyn University of Agriculture and Technology (Polen)

Kooperation zwischen dem Institut für Tierzucht  und Haustiergenetik und Prof. Dr. Meisel, Institut für Chemie und Technologie der Milch der Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel (BfEL)


Bedeutung von Kuhmilcholigosacchariden unterschiedlicher Rassen auf intestinalen Epithelzellen

Der Gastrointestinaltrakt des Früh- und Neugeborenen gehört zum Zeitpunkt der Geburt zu den noch nicht vollständig entwickelten Organen. Er unterliegt in den ersten Wochen und Monaten nach der Geburt noch einer Vielzahl von Reifungsprozessen, um letztendlich seine volle Funktion zu erfüllen. Dazu gehört auch die Entwicklung eines vollständig intakten intestinalen Immunsystems (GALT; gut associated lymphoid tissue). Beim Neugeborenen sind die grundlegenden immunologisch wirksamen Komponenten zwar schon vorhanden, jedoch sind ihre Wirkungen und in ihre Leistungsfähigkeit stark vermindert. Damit ist das Neugeborene empfindlich gegenüber exogener Bestandteilen und Infektionen, sodass das Risiko für das Auftreten neonataler Infektionen erheblich gesteigert ist. Vor allem die konstitutive Sekretion von inflammatorisch wirksamen Mediatoren durch die Enterozyten des Epitheliums spielt bei der lokalen Immunantwort eine große Bedeutung. Dies zeigt sich vor allem darin, dass eine Vielzahl von Zytokinen in nur moderaten Konzentrationen im Vergleich zum Erwachsenen beim Säugling nachweisbar ist, und dies mit einem erhöhten Infektrisiko assoziiert ist. Die Ernährung des Neugeborenen spielt in diesem Zusammenhang eine entscheidende Rolle, wobei Frauenmilch durch ihren Gehalt an Wachstumsfaktoren, Immunglobulinen und komplexen Oligosacchariden ein positiver Einfluss zugeschrieben wird. Bereits nach wenigen Wochen wird ein zunehmender Teil der Säuglinge mit Milchformulae ernährt, die auf Kuhmilch basieren. Daher ist es von großem Interesse, inwieweit Bestandteile wie Oligosaccharide, die in Frauenmilch in hohen Konzentrationen von 5-10 g/l vorkommen und in reifer Kuhmilch weniger als 1g/l ausmachen, ähnliche Effekte am intestinalen Epithel zeigen. Da zudem die Oligosaccharidzusammensetzung von der genetischen Ausstattung in Bezug auf das Vorkommen einzelner Glykosyltransferasen determiniert ist, wurden hier Oligosaccharide aus Milchen verschiedener Rinderrassen auf die Immunantwort der humanen, intestinalen Zelllinie HT-29 untersucht.

Ausgangssubstanz für die Untersuchungen war Kolostralmilch von Kühen unterschiedlicher Rassen. Hierbei handelte es sich um die Deutsch-Holsteinische Rotbunte (A), die Deutsch-Holsteinische Schwarzbunte (B), die Jersey (C) und das Deutsche Fleckvieh (D).

Zur Isolierung der Oligosaccharide aus der Milch der unterschiedlichen Kuhrassen wurde die Milch zunächst entfettet, von Proteinen getrennt und die Laktose (Gelfiltration) entfernt. Die übriggebliebene Fraktion stellte die Oligosaccharidfraktion dar und wurde nach der Fraktionierung in dem Anionenaustausch-Chromatographie-System mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD) weiter charakterisiert. In Abbildung 2 sind die HPAEC-PAD – Chromatogramme der Oligosaccharidfraktionen der unterschiedlichen Rassen dargestellt.

Mit Hilfe des sog. Proteoplex Microarrays (MERCK) wurde ein Panel von 12 Zytokinen als Reaktion auf eine 6stündige Inkubation mit Kuhmilcholigosacchariden in einer Konzentration von 10 mg/ml bestimmt. Um mögliche zelluläre Targets der Oligosaccharid-induzierten Effekte zu identifizieren, wurde zum einen mittels quantitativer RT-PCR das Expressionsniveau von Zielproteinen wie NF-κB bestimmt und zum anderen mit Hilfe des sog. ProteomProfilers (R&D) die Aktivierung zellulärer Proteinkinasen.
Bei der Untersuchung der Zytokinexpression konnten wir zeigen, dass vor allem die Sekretion des Granulozyten-Monozyten Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF) und die Interleukin-8 Sekretion deutlich erhöht wurden. Diese erhöhte Sekretion war in allen Fällen mit einer Zunahme der NF-κB Expression verbunden, sowie einer Aktivierung der Proteinkinasen p38 und PKB.
Vor dem Hintergrund, dass die IL-8 Sekretion ein NF-κB abhängiger Prozess ist und dieser sowohl durch die Expression des GM-CSF, als auch durch die Aktiveirung von Proteinkinasen die als Target den inaktiven NF-κB-Komplex haben, scheint dies ein möglicher Mechanismus für die gezeigte Wirkung der Kuhmilch-Oligosaccharide zu sein.

Weitere Informationen erhalten Sie auf der Homepage der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Clemens Kunz.

MEU-Vernetzung und externe  Kooperationen
Nutzung der „MEU-Methodenplattform Stabile Isotope und Zellbiologie” für Funktionsstudien.


Vorträge
Kunz C (2004): Genetische Varianten in der Milch – Bedeutung für Tierzucht und Humanernährung. Hochschultagung des Fachbereichs 09 der JLU Gießen

Kunz C (2006)
Oligosaccharides in Human versus Bovine Milk – Potential Health Benefits.
Meeting “International Dairy Federation”, Brüssel

Kunz C (2006)
Die Milch macht‘s? – Von frühkindlicher Ernährung und Erkrankungen im Alter.
Hochschultagung des Fachbereichs 09