DFG-Sachbeihilfe KR1143/12-1 „Entschlüsselung funktioneller Master-Enhancer-Regime, die eine Entzündungsstimulation bewirken"

Kurzbeschreibung:

Die Entzündung ist ein evolutionär konservierter Prozess, innerhalb dessen entzündliche Zellreaktionen an multiplen Kontrollpunkten im Körper koordiniert und reguliert werden. Ein Versagen dieser Mechanismen führt zu überschießenden akuten oder chronischen Entzündungen, welche ursächlich mit Organschäden, Gewebealterung und Krebs in Verbindung gebracht werden.

Therapeutische Erfolge der letzten zwanzig Jahre unterstreichen die (klinische) Bedeutung der pharmakologischen Antagonisierung von Zytokinen wie IL-1α/β und TNFα, allerdings sind entzündliche Erkrankungen weiterhin nicht heilbar. In diesem Projekt werden molekulare Mechanismen der Zytokin-abhängigen dreidimensionalen Genomorganisation und -funktion mit dem Ziel analysiert, die nukleäre Koordination entzündlicher Genexpressionskaskaden mit größtmöglicher Präzision zu erfassen und zu modulieren.

Die Antragsteller konnten gemeinsam eine neue Regulationsebene der nukleären IL-1α-Reaktion entschlüsseln, wobei IL-1α akute Veränderungen der Chromatin-Zugänglichkeit in Regionen hervorruft, in denen Entzündungs-relevante Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) angereichert sind. Sie identifizierten mittels CRISPR-Cas9-basierten Mikrodeletionen zwei IL-1α-regulierte Enhancer im Chemokin Locus auf Chr. 4 sowie eine dominante Rolle des IL8-"Master-Enhancers" bei der Regulation weiterer Entzündungsgene. 

In dem beantragten Projekt soll die Hypothese getestet werden, dass die hochgradig koordinierte zelluläre Entzündungsreaktion spezialisierte genomische "Hubs" benötigt, in denen multiple Enhancer interagieren und mit unterschiedlicher Stärke mehr als ein Gen regulieren. Hierzu soll die Fragen geklärt werden, wie viele weitere inflammatorische "Master"-Enhancer im menschlichen Genom existieren und welche Faktoren es diesen Enhancern ermöglichen, einen spezifischen Zytokin-responsiven Funktionszustand zu erlangen.

Im Arbeitspaket (AP) 1 wird das genomweite Repertoire dynamischer Entzündungs Enhancer mittels einer Kombination aus Mikro-C, Einzelzell-ATAC-seq kombiniert mit RNA-seq, (nascent) RNA-seq und neuen bioinformatischen Werkzeugen umfassend untersucht und anhand der Enhancer-Stärke kartiert. In AP2 wird die molekulare Zusammensetzung von Enhancer-Hubs durch Isolierung lokusspezifischer Proteinkomplexe im Kontext von transcription factories mit Hilfe proteomischer Ansätze aufgedeckt werden. In WP3 wird die Funktion der neu entdeckten "Master" Enhancer mit Hilfe von CRISPR-gesteuerten Interferenzscreens, molekularer Bildgebung von Transkriptionsstellen und nativen 4C-Assays von perturbierten genomischen Loci und nukleären Faktoren aufgeklärt werden.

Falls erfolgreich, werden die geplanten Ansätze neue Erkenntnisse zur Funktion hierarchisch organisierter Enhancer in ihrem endogenen Kontext und zur Selektion und Auswahl von Enhancern in Zytokin-responsiven Systemen generieren und uns damit dem Ziel der Manipulation von genomischen Enhancern bei (chronischen) entzündlichen Erkrankungen näher bringen.

Short Summary:

Inflammation is an evolutionarily conserved process in which inflammatory cellular responses are coordinated and regulated at multiple checkpoints in the body. Failure of these mechanisms leads to excessive acute or chronic inflammation, which is causally associated with organ damage, tissue aging and cancer.

Therapeutic successes over the last twenty years highlight the (clinical) importance of pharmacological antagonization of cytokines such as IL-1α/β and TNFα, however inflammatory diseases remain incurable. In this project, molecular mechanisms of cytokine-dependent three-dimensional genome organization and function are being analyzed with the goal of capturing and modulating the nuclear coordination of inflammatory gene expression cascades with the greatest possible precision.

In a collaborative effort, the applicants were able to decipher a new level of regulation of the nuclear IL-1α response, whereby IL-1α induces acute changes in chromatin accessibility in regions enriched in single nucleotide polymorphisms (SNPs) relevant to inflammatory diseases. Using CRISPR-Cas9-based microdeletions, they identified two IL-1α-regulated enhancers in the chemokine locus on Chr. 4 and a dominant role of the IL8 "master enhancer" in the regulation of further inflammatory genes.

The proposed project will test the hypothesis that the highly coordinated cellular inflammatory response requires specialized genomic "hubs" in which multiple enhancers interact and regulate more than one gene with different strengths. To this end, the questions of how many additional inflammatory "master" enhancers exist in the human genome and which factors enable these enhancers to acquire a specific, cytokine-responsive functional state will be addressed.

In Work Package (WP) 1, the applicants will comprehensively identify the genome-wide repertoire of dynamic inflammatory enhancers using a combination of micro-C, combined single cell ATAC-seq and RNA-seq, (nascent) RNA-seq, and novel bioinformatics tools and map them based on enhancer strength. In WP2, the molecular composition of enhancer hubs will be revealed by isolating locus-specific protein complexes in the context of transcription factories using proteomic approaches. In WP3, the function of newly discovered "master" enhancers will be elucidated using inactive Cas9 and CRISPR-directed interference screens, molecular imaging of transcription sites, and native 4C assays of perturbed genomic loci and nuclear factors.

If successful, the planned approaches will generate new insights into the function of hierarchically organized enhancers in their endogenous context and into enhancer selection and choice in cytokine-responsive systems, bringing us closer to the goal of manipulating genomic enhancers in (chronic) inflammatory diseases.